INTRODUCCIÓN

El primer éxito en la transferencia de embriones (TE) de mamíferos fue en 1890, aproximadamente, 60 años antes de que se informara sobre un avance significativo en la tecnología básica de la TE en el ganado bovino (1890). A partir de 1970, la tecnología avanzó lo suficiente como para realizar programas de TE. La tecnología está comercialmente establecida en los países desarrollados, con programas estructurados entre la industria y las empresas ganaderas para realizar la mejora genética de las razas de ganado, además de disminuir problemas reproductivos y sanitarios (Hasler 2014).

Los métodos más importantes de criopreservación por congelación de embriones para transferencia son curva lenta y la vitrificación (Martínez 2008). El método de curva lenta utiliza equipos programables, que congelan los embriones a temperatura y tiempo determinados. Mientras que la vitrificación los congela de forma rápida en nitrógeno líquido a -196 °C (Saragusty y Arav 2011). Por curva lenta se ha obtenido 41 % de gestación en receptoras Bos indicus x Bos taurus en la región tropical de Brasil (Bényei et al. 2006) y 45 % con embriones bovinos producidos in vitro (Youngs 2011). La vitrificación se considera superior a la curva lenta, ya que no genera cristales de hielo intracelular y produce niveles de gestación sólo 10 % inferiores a los de embriones frescos (Hasler 2014). Con embriones vitrificados, se ha obtenido 65 % de gestación en receptoras Holstein, en España (Hidalgo et al. 2004), y 45 % en receptoras Polled Hereford, en Argentina (Martínez y Valcárcel 2008). La criopreservación es un procedimiento fiable en embriones producidos in vivo, aunque requiere de mejoras para embriones in vitro (Hasler 2014). La TE y la inseminación artificial pueden contribuir a la difusión y preservación de razas en peligro de extinción, como la Criollo Lechero Tropical (CLT) (FAO 1981), a través de la formación ex situ de bancos de germoplasma de embriones y pajillas de semen. Asimismo, posibilitan obtener animales puros en periodos más breves que a través de encaste (Hasler 2014).

El CLT es una raza productora de leche adaptada a los climas cálidos (Rosendo-Ponce y Becerril-Pérez 2015), pero requiere de biotecnologías reproductivas avanzadas para su conservación, difusión entre criadores de la raza, ganaderos y comercialización nacional e internacional. La crio-preservación y la TE pueden contribuir a producir animales genéticamente superiores para aumentar la producción de leche en México y otros países (SIAP 2013). Por lo anterior, el objetivo del estudio fue comparar los métodos de criopreservación por curva lenta y vitrificación, en embriones CLT transferidos a hembras puras y mestizas.

MATERIALES Y MÉTODOS

El estudio se realizó en el Colegio de Postgraduados Campus Veracruz (CP) y el rancho Los Encinos (OG). El CP está ubicado en el municipio de Manlio Fabio Altamirano, Veracruz, en las coordenadas 19°11`38" N y 96°20`13" O, con una altitud de 23 msnm. Tiene una superficie ganadera de 40 ha, con relieve irregular y diferencia de altitud de 14 a 19 msnm. El clima es cálido subhúmedo, AW₁ (w) (i`) g, con temperatura media anual de 26.5 °C y precipitación fluvial anual de 1230 mm, distribuida de mayo a octubre. El rancho Los Encinos está ubicado en el municipio de Olinalá, Guerrero, en la Región de la Montaña en las coordenadas 17° 59‘ 51" N y 98° 52' 08" O, con altitud de 1284 msnm. La superficie ganadera es de 100 ha, con pendientes pronunciadas y relieve irregular. Predomina el clima semicálido subhúmedo AwO (w), con temperatura media anual de 22 °C y precipitación media anual de 800 mm, con lluvias predominantes de julio a septiembre (García 1988).

En el CP, se seleccionaron 20 hembras reproductoras que se encontraban ciclando, permitieron el paso del aplicador y no presentaron quistes ovári-cos o fibrosis en el tracto uterino. Se seleccionaron 11 CLT y nueve mestizas (Suizo Pardo x Cebú) de 64.8 ± 5.1 meses de edad y 439.2 ± 12.1 kg de peso. Por otro lado, en OG se seleccionaron 20 hembras receptoras multíparas, lactancia de más de 90 d, con iguales condiciones uterinas que en el CP. Se seleccionaron 10 CLT y 10 mestizas (CLT X Europeo) de 92.1 ± 5.2 meses de edad y peso de 382.8 ± 7.1 kg. En CP y OG, la condición corporal de las hembras fue de 2.80 ± 0.01 y 2.78 ± 0.10 kg, en escala 1 (emaciado) a 5 (obeso) (Houghton et al. 1990). El número de unidades experimentales (hembras receptoras) fue reducido en comparación con otros estudios realizados en razas lecheras de clima templado, ya que la población de hembras CLT es pequeña y está en peligro de extinción (FAO 1981). Cada hembra receptora fue desparasitada con iver-mectina al 1 % (Virbamec classic) y con amitraz a 12.5 % (Bovitraz). Se detectaron celos dos veces al día, de 8 a 9 h y de 17 a 18 h, durante un mes, mediante la observación directa de montas, montas fallidas, intentos de monta, la presencia de flujo vaginal y ocurrencia de sangrado tres días después de la presencia del celo.

Alimentación de las receptoras

En el CP, las receptoras se pastorearon en potreros de grama nativa (Paspalum spp), estrella africana (Cynodon plectostachyus) y pará (Brachiaria mutica), bajo rotación. Previo a la TE, se les proporcionó durante 50 d 1 kg d^-1 animal^-1 de suplemento comercial con 18 % de proteína cruda y agua a libre acceso. Las receptoras se separaron al inicio del experimento y dos días antes de la TE, en una báscula digital móvil True Test. Las receptoras en OG, pastorearon en potreros de grama nativa (Paspalum spp) y leguminosas locales, como el tlahuitol (Lysiloma divaricatum) y guaje blanco (Leucaena leucocephala). A cada receptora se le suministró un concentrado comercial con 18 % de proteína cruda, pollinaza y maíz molido, a razón de 1.5, 1.5 y 0.5 kg durante 60 d. Las receptoras se pesaron dos días antes de la TE. Cada receptora se inyectó de forma intramuscular con 8 ml de seleselenio y vitamina E (Mu-Se^®) (Essex Animal Health Friesoythe). Además, de 10 mi de Butafosfan y protector hepático (Catosal ^M.R. con vitamina B 12) (Bayer HealthCare) en los días 15 y 30 previos a la sincronización de celo.

Selección de embriones para transferencia

Todos los embriones provenían de óvulos de hembras CLT puras, inseminadas con semen de toros CLT de registro. Se utilizaron 19 embriones por curva lenta y 21 por vitrificación de calidad uno, asignándose aleatoriamente 10 a cada método de criopreservación al CP y los restantes a OG. Cada embrión criopreservado por curva lenta se colocó de forma individual en una pajilla de 0.25 mi y se identificó con datos de la donadora. Entre uno y cuatro embriones criopreservados por vitrificación se colocaron en cryotops y se identificaron por donadora, cantidad y calidad.

Protocolo de sincronización del celo

Las receptoras sincronizaron con estrógenos y progestágenos. En el día cero, se les colocó un dispositivo intravaginal liberador de progesterona (P₄) (1.9 mg) (CIDR 1900 cattle insert, DEC Manufacturing N2 Pfizer) y se les inyectó vía intramuscular 2 mg de benzoato de estradiol (Be₂) (Estilbo vitaminado, SYVA); en el día cinco, se le inyectó 400 Ul de gonadotropina coriónica equina (Folligon 1000 U.l. Intervet) y 5 mi de prostaglandina F_2α (PGF_2α) (Lutalyse, Pharmacia Upjohn, Pfizer USA); mientras que en el día ocho, se les retiró el dispositivo intravaginal e inyectó 1 mg de cipionato de estradiol (Ce₂) (ECP Pfizer). Al 10 d se observaron signos relacionados a la presencia de celo, por lo que se previo la ocurrencia de ovulación en las siguientes 24 h; mientras que al día 17 se diagnosticó, vía palpación rectal, la presencia de cuerpos lúteos en los ovarios y se depositó el embrión en el cuerno uterino.

Proceso de transferencia de embriones

Las pajillas con embriones congelados por curva lenta se extrajeron del termo criogénico y se sumergieron en agua a 37 °C durante 30 s, se retiró el tapón y se colocaron en el aplicador de transferencia. Los embriones vitrificados se extrajeron del cryotop y se sumergieron en una gota de 500 μl de una solución de calentamiento (SC) a 37 °C por 1 min, para luego colocar dos gotas de una solución de dilución (SD) a temperatura ambiente por 2 min, para luego exponer en tres gotas de 20 μl en una solución de lavado (SL), durante 3 min (Kuwayama, 2007), para finalmente, cargar en una pajilla de 0.25 mi con solución PBS (Bioniche, Pharma, Cánada) y colocar en el aplicador de transferencia. La SC estuvo compuesta de PBS, sustituto de suero sintético (SSS) a 20 % y sucrose 1 M (Sigma-Aldrich); la SD de PBS, SSS a 20 % y sucrose 0.5 M y la SL de PBS y SSS a 20 %.

Al momento de la TE, se determinó la presencia de un cuerpo lúteo mayor de 1.5 cm de diámetro, se realizó asepsia del perineo y se inyectó vía epidural lidocaína (Pisicaina 2 %, PISA); un aplicador metálico de transferencia cubierto con una funda estéril, se introdujo en la vagina, hasta el cuerpo lúteo palpado (Hafez y Hafez 2002). El diagnóstico de gestación se realizó mediante palpación rectovaginal 50 d después de la transferencia. Todo el proceso de TE se realizó en condiciones de campo de clima cálido tropical, lo que pudo influir en los resultados.

Análisis estadístico

En CP y OG, los tratamientos se asignaron de forma aleatoria a las receptoras de ambos genotipos. En CP, por curva lenta, seis embriones para CLT y cuatro para mestizas, y cinco vitrificados en receptoras CLT y cinco en mestizas. En OG, la asignación de tratamientos a receptoras de ambos genotipos fue de cuatro embriones por curva lenta en receptoras CLT y cinco en mestizas; para embriones vitrificados, seis en receptoras CLT y cinco en mestizas. Las variables de respuesta fueron estado de gestación (1 gestante, 0 no gestante) y el tamaño del cuerpo lúteo (1 pequeño, 2 mediano y 3 grande). Los datos se analizaron utilizando la prueba exacta de Fisher, con el PROC FREQ del SAS (SAS Insitute 2010).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

No se encontraron efectos significativos de método de criopreservación y de genotipo de las receptoras (p > 0.05). Los niveles de gestación por método de criopreservación fueron 10 y 20 % para curva lenta y vitrificación en CP (p ≤ 0.50), y 11 y 27 % en OG (p ≤ 0.375).de gestación por genotipo fueron 27 y 0 en CP (p ≤ 0.145) y 30 y 10 % en OG (p ≤ 0.294) para receptoras CLT puras y mestizas (Figura 1). Se observó una tendencia consistente de mayor porcentaje de gestación para la vitrificación en receptoras CLT puras. Se obtuvo aproximadamente una cuarta parte de lo reportado en la literatura, por curva lenta y aproximadamente la mitad de lo reportado en la literatura, por vitrificación. Del total de hembras CLT 28.6 % y sólo el 5.6 % de las mestizas quedaron gestantes. Los niveles de gestación fueron menores a 48.6 %, obtenido con embriones criopreservados por curva lenta y transferidos a receptoras mestizas Bos Taurus x Bos in-dicus en Venezuela (Gonzáles et al. 1997). Sin embargo, fueron más cercanos a 33.2 y 13.9 % en condiciones templadas y en época cálida en vacas receptoras Holstein lactantes del altiplano central de Aguascalientes, México (Lozano et al. 2010). El estrés calórico puede afectar el medio materno interno para establecer la gestación y reducir el desarrollo y viabilidad inicial de los embriones producidos tanto in vivo como in vitro (Jousan y Hansen 2004). En Brasil, con embriones Holstein congelados por curva lenta transferidos a receptoras Bos indicus x Bos taurus, se obtuvo 41 % de gestación (Bényei et al. 2006). Mientras que en Florida, con embriones Romosinuano y Brahmán transferidos a receptoras Angus x Brahmán, se obtuvo entre 49 y 54 % de gestación (Hernández et al. 2004), mientras que Chase et al. (2009) encontraron que la edad de las receptoras y la calidad del embrión afectaron el porcentaje de gestación.

Para los embriones CLT obtenidos por curva lenta en el presente estudio, los porcentajes de gestación fueron menores a los indicados por otros autores (Gonzáles et al. 1997, Bényei et al. 2006, Chase et al. 2009, Youngs 2011), aunque similares a lo indicado por Lozano et al. (2010). En el CP, la transferencia se realizó durante junio y julio, con temperaturas medias de 34.4 °C, lo que pudo afectar la viabilidad del embrión y disminuir el porcentaje de gestación. Por su parte, en OG la transferencia se realizó en octubre, con temperaturas medias de 22.5 °C. Al respecto, Oyuela y Jiménez (2010) mencionan que factores como el manejo de las receptoras, traumatismos del animal y una deficiente alimentación y suplementación mineral pueden reducir el porcentaje de gestación de la TE.

La criopreservación por vitrificación es mejor que por curva lenta, ya que se utilizan soluciones acuosas concentradas de agentes crioprotectores que impiden la formación de cristales de hielo en el embrión durante su enfriamiento. El porcentaje de gestación con embriones producidos in vivo y congelados por vitrificación es 10 % menor al que se obtiene con la transferencia de embriones frescos (Hasler 2014). En receptoras Holstein, con ello se ha logrado 55 % de gestación (Chebel et al. 2008); mientras que en receptoras de 15 a 18 meses de edad, bajo temperaturas medias de 12.2 y 17.3 °C, se obtuvo 64.9 % de gestación (Hidalgo et al. 2004); por otro lado, en receptoras lactantes, el porcentaje de gestación ha sido de 34.5 % (Rodríguez et al. 2010). Al respecto, Dochi et al. (2008) indican que las vaquillas son las receptoras más adecuadas, por tener menor incidencia de estrés nutricional, enfermedades uterinas y problemas post-parto; por lo anterior, un mayor número de vaquillas responden al tratamiento de sincronización con progesterona y quedan gestantes con la TE (Stroud y Hasler 2006). Aunque las hembras CLT podrían ser menos sensibles a condiciones adversas de temperatura y humedad altas, debido a su adaptación a climas cálidos tropicales (Santellano et al. 2011), los menores porcentajes de gestación pueden atribuirse a factores endocrinos, celulares y moleculares (Fuentes y de la Fuente 2007). La calidad y el estado de desarrollo del embrión influyen en el éxito de la TE. Se obtiene menor porcentaje de gestación con mórulas que al transferir embriones en estado más avanzado (Looney et al . 2006). Al respecto, Hasler (2001) encontró porcentajes de gestación estadísticamente diferentes para embriones calidad uno (73.2 %), dos (68.3 %) y tres (56.3 %), pero no encontró diferencias entre diversos estados de desarrollo. Mientras que Oyuela y Jiménez (2010) indican que el porcentaje de gestación es mayor cuando se transfieren embriones de la mejor calidad y en estado de desarrollo de blastocisto.

En CP, 40 % de las receptoras presentó cuerpo lúteo calidad tres y 40 %, calidad dos, con diámetros superiores a 1.5 cm, tamaño que se considera óptimo para realizar la TE; por otro lado, 20 % presentó cuerpos lúteos calidad uno, cuyo diámetro fue inferior a 1.5 cm, lo cual es no apropiado para hacer la transferencia; sin embargo, a todas las receptoras en CP se les transfirió un embrión. Todas las receptoras en OG presentaron cuerpo lúteo, 45 % calidad tres y 55 % calidad dos, con diámetro superior a 1.5 cm (Figura 2). Un cuerpo lúteo grande mantiene la producción de progesterona, lo que propicia mayor pocentaje de gestación después de la TE (Baruselli et al. 2010); sin embargo, se ha encontrado que no existe correlación entre el tamaño del cuerpo lúteo, la concentración de progesterona y el porcentaje de gestación de las receptoras (Tovío et al. 2008, Herzog et al. 2010, Butler et al. 2011, Hasler 2014). Al respecto, Vieira et al. (2014) mencionan que la evaluación de la calidad del cuerpo lúteo en receptoras puede mejorar la precisión en la selección de receptoras y aumentar el porcentaje de gestación.

Se concluye que los porcentajes de gestación fueron similares entre la criopreservación por curva lenta y vitrificación, entre receptoras CLT purasy mestizas, y fueron menores a los estimados en otros estudios con otras razas y en condiciones ambientales favorables. No se tiene evidencia de qué factores influyeron en los bajos porcentajes de gestación, aunque la tendencia fue un mayor porcentaje de gestación para vitrificación y receptoras CLT puras. Se sugiere realizar estudios que consideren la endocrinología y fisiología reproductiva de las receptoras y el seguimiento del proceso de maduración del embrión.

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